Najłatwiejszy Sposób Na Rozwiązanie Problemów Z Półilościowym PCR

Przestań marnować czas na błędy komputera.

1. Pobierz i zainstaluj ASR Pro

2. Uruchom program i kliknij „Skanuj”

3. Kliknij „Napraw”, aby naprawić wszelkie błędy wykryte podczas skanowania

Kliknij tutaj, aby bezpłatnie pobrać to potężne narzędzie do optymalizacji komputera.

W tym poradniku zidentyfikujemy kilka możliwych przyczyn, które mogą prowadzić do półilościowego rozwiązywania problemów z PCr, a następnie przedstawię potencjalne metody naprawy, które wielu z was może spróbować naprawić nowy problem.Półilościowa reakcja PCR zapewnia krótką metodę oceny względnego obciążenia komunikacją w populacjach RNA przy użyciu nowego znanego genu porządkowego jako znanego standardu wewnętrznego w celu normalizacji poziomów ekspresji genu docelowego związanego z zainteresowaniem.

Wznów

Opisujemy standardowy półilościowy protokół RT-PCR, który nasze laboratorium zoptymalizuje dla roślinnego RNA z mniej niż 10 000 komórek i mierzy części lokucyjne kilku docelowych mRNA dla każdej próbki. Metoda ta została opracowana podczas szlaku TF-1 komórek erytroleukemicznych u ludzi, ale została z powodzeniem zastosowana bezpośrednio do komórek pierwotnych i powracania do komórek na różnych liniach bezprzewodowych. Szczegółowo opisujemy dostępne taktyki analizy punktów Bcl-2. Aldolaza A została wykorzystana jako czas kontroli wewnętrznej do normalizacji zmienności próbki w całkowitym poziomie RNA i wydajności odpowiedzi. Ponieważ zawiera wszystkie metody ilościowe, można zachować wielką ostrożność na wszystkich etapach poprawy: komórki.

Słowa kluczowe: reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkryptazą, RNA, komunikator, ekspresja genów, geny, bcl-2

Prezentacja

Odwrotna transkrypcja za pomocą reakcji polimerazy łańcuchowej (RT-PCR) to bardzo specjalna i specyficzna metoda, która nadaje się do wykrywania rzadkich transkryptów lub po prostu do analizy dostępnych próbek działający w mniejszych ilościach (1,2). W większości ochronnych przypadków, w których wymagana jest analiza RNA, przyzwoite badania jakościowe nie wystarczają do uzyskania zadowalającej kreatywnej odpowiedzi. Tradycyjnym tematem jest ilościowa ocena poszczególnych transkryptów RNA i detektory wszelkich zmian w ich zdolnościach werbalnych w różnych warunkach eksperymentalnych. Często stajemy przed problemem ujawnienia słabo wyrażonych transkryptów i przetworzenia szczególnie małej liczby pojedynczych próbek, takich jak kluczowe komórki hematopoetyczne (3,4) lub biopsje guza u mężczyzn i kobiet (5-7). Jeśli istnieje prawdopodobieństwo, że badania na ludziach będą faktycznie prowadzone w modelach pierwotnych, nie wspominając o liniach kredytowych z komórkami potwierdzonymi i przekształconymi w warunkach wymagających drogich odczynników, wówczas badania należy przeprowadzić przy użyciu niezawodnej, czułej techniki. wykonać ograniczoną liczbę eksperymentów dla każdej próbki. Wiele udoskonalonych protokołów i metod PCR jest dostępnych jako drugie, które należy omówić w całym tym artykule, ale nie wszystkie z nich są łatwo dostępne dla każdego standardowego laboratorium, a zatem mają zarówno słabe strony, jak i zalety, w odniesieniu do których są przeznaczone . Chociaż odtwarzalność jest zawsze krytyczna W rzeczywistości produkt nie może być niezwykle dokładny: większość wyszukiwań niekoniecznie koncentruje się na ocenie małych zmian lub dokładnej liczbie cząsteczek w ludzkim ciele, ale wyłącznie na zwiększeniu lub co najmniej 1,2-krotnym zmniejszeniu ekspresji poziom. … Tak więc, nawet przy jeszcze większej precyzji metod opracowanych w minionym tygodniu, metody półilościowe są obecnie szeroko stosowane i są poprawne dla wielu celów. Tutaj szczegółowo opisujemy ogólną procedurę, która została faktycznie zoptymalizowana w naszym laboratorium pod kątem usług określania poziomów Bcl-2, wybierając aldolazę A jako kontrolę wewnętrzną, nie wspominając o niektórych kontrolach wymaganych tylko do oznaczania ilościowego. Podano przykłady badań więcej niż kilku markerów i większość uzyskanych danych.

Materiały i metody

Ekstrakcja RNA

Izolacje RNA przeprowadzono przy użyciu zestawu RNeasy Mini-Kit (Quiagen, Hilden, Niemcy) zgodnie z częstymi zaleceniami producenta. Zwykle 2c 10 ⁵ komórek, podczas gdy liczba komórek od x dziesięć ⁴ do x10 ^siedem została z powodzeniem użyta. TrackTe macierze są zoptymalizowane pod kątem linii komórkowej erytroleukemii TF-1 (8), a wyzwanie zostało przetestowane przy użyciu limfocytów aktywowanych fitohemoaglutyniną, ale przetestowano również wyjątkowe linie komórkowe, początkowe komórki krwiotwórcze w połączeniu z nieznanymi biopsjami wzrostu. … Próbki wytrząsano przez ekstremalnie 1 minutę w celu oddzielenia genomowego DNA przed załadowaniem na minikolumny RNeasy, a następnie eluowano co najmniej czterdziestoma pięcioma μl i maksymalnie około x 50 μl wolnej od RNaz tego typu wody. RNA wytwarzane przez twój roztwór jest prawie luźno połączone z ostatecznie genomowym DNA. Jeśli używasz pozostałych metod ekstrakcji lub pracujesz z próbkami masy tkankowej, leczenie DNazą, które znalazłem, prawie ekstrakcja fenolem i opad etanolem, zostało po prostu wykorzystane do usunięcia stresu związanego z zanieczyszczeniem DNA (9).

Odwrotna transkrypcja

RNA uzyskane pierwotnie z 20 000 mikroskopijnych komórek było widoczne w zasięgu 5 mM MgCl _{tylko dwa}, 1X bufor PCR II, 1 milimetr dNTP, 5 jednostek. odwrotna transkryptaza MuLV, 1 jednostka, Uppsala, Szwecja), 2,5 μM losowych heksamerów w końcowej objętości reakcyjnej końcówek wynoszącej 20 μl. Wszystkie odczynniki były przeznaczone dla firmy Applied pe Biosystems, o ile nie zaznaczono inaczej. Reakcje pobrano w 42 ° C, biorąc pod uwagę 30 minut w Gene Amp PCR System 9600 (PE Applied Biosystems), a następnie dziesięciominutowe plateau co 99 ° C aż do denaturacji cząsteczki, a następnie schłodzenie do 8° w porównaniu do / P >

PCR

a) Reakcja standardowa dla Bcl-2

Dwie μl oferty cDNA zmieszano z 1 jednostką połączonego wzmacniacza Taq Gold (PE Applied Biosystems) w buforze dostarczonym przez tego producenta, nie zawierającym MgCl _{jeden lub dwa} , oraz ze specyficzną obecnością starterów specyficznych dla Bcl-2, patrz także startery aldolazy A (6) otrzymane jako procedura wewnętrzna, biorąc pod uwagę opisaną poniżej. Orientacyjna ilość dNTP niesionych przez przeciwną reakcję transkrypcji jest całkowicie wystarczająca do dodania do amplifikacji. Reakcje przeprowadzono w prawie Gene Amp System pcr 9600. Pierwszy cykl 10 minut w 92°C, 45 sekund w 55°C i 1 minuta w siedemdziesięciu dwóch°C, następnie 45 sekund w 95°C, 45°C sekund. w 65 ° C, dodatkowa 1 minuta w 72 ° C, aby uzyskać 30 cykli (patrz poniżej). Warunki wzrostu dobrano tak, aby żaden z analizowanych RNA po zakończeniu amplifikacji nie osiągnął poziomu kompetencji, tj. znajdowały się w fazie związanej z szybką amplifikacją, oraz hTak, aby znaczna większość z dwóch zestawów starterów była zużyte, każda reakcja była nie tylko. nie podążaj za każdą alternatywą (patrz poniżej opis najważniejszych niezbędnych regulacji i definicję przy odpowiednim typie parametru). Każdy zestaw reakcji Always wykorzystywał nieprzyjemną kontrolę bez próbki. Cieszyliśmy się głównie kontrolą negatywną, która bezpiecznie zawierała RNA zamiast cDNA, aby chronić przed zanieczyszczeniem łatwo dostępnego genomowego DNA. Przetwarzaliśmy polimerazy Taq między różnymi źródłami, na szczęście mamy regularny protokół z AmpliTaq Gold (PE Applied Biosystems).

Kliknij tutaj, aby bezpłatnie pobrać to potężne narzędzie do optymalizacji komputera.

Semi Quantitative Pcr Troubleshooting
Ustranenie Nepoladok Polukolichestvennoj Pcr
Depannage Pcr Semi Quantitatif
Risoluzione Dei Problemi Di Pcr Semiquantitativo
Solucao De Problemas De Pcr Semiquantitativo
Semikvantitativ Pcr Felsokning
Semi Kwantitatieve Pcr Probleemoplossing
Solucion De Problemas De Pcr Semicuantitativa
Halbquantitative Pcr Fehlerbehebung
반정량적 Pcr 문제 해결